基础研究视网膜母细胞瘤房水及肿瘤组织的基

摘要

目的初步分析视网膜母细胞瘤患者房水及肿瘤组织中的基因组信息的一致性。方法选取两例经保眼治疗失败行眼球摘除的患儿，对其房水的游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）以及肿瘤组织的基因组DNA（genomicsDNA，gDNA）采用超低深度全基因组测序（ultralowfluxwholegenomesequencing，ulf-wgs）和基于隐马尔可夫模型的ichorCNA软件，分析体细胞染色体拷贝数变异（somaticchromosomalcopy-numberalterations，SCNA）和肿瘤比例（tumorfraction，TF）情况。结果实验获得两例病例质量良好的肿瘤组织gDNA、房水样本cfDNA。分析显示4例样本的肿瘤分数均大于10%，可灵敏反映样本的SCNA情况。两例病例的房水样本中，最常见的拷贝数增加区域包括1q、6p和13q，最常见的拷贝缺失区域包括6q和8p。病例1患者房水和肿瘤样本的SCNA区域高度一致，均出现1q、6p以及13号和18号染色体的扩增，6q及8p的拷贝数缺失。病例2患儿的房水在1p、6q、8p和13q区域都显示SCNA变异。结论房水活检及经济的ulf-wgs有望成为视网膜母细胞瘤疗效评估和预后的新标准。

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。自年Abramson等[1]报道经眼动脉灌注化疗（intra-arterialchemotherapy，IAC）治疗RB以来，IAC联合局部治疗（激光、球注、冷冻等）已经成为RB的重要治疗方法，提高了患儿的保眼率，但仍有部分患儿对IAC治疗不敏感，需及早摘除眼球以避免肿瘤向眼球外转移[2]。

目前，预测RB的保眼治疗的疗效仅是基于临床的肿瘤分期，包括肿瘤大小、视网膜脱落和肿瘤种植等。然而最常用的RB肿瘤国际分期（intraocularinternationalretinoblastomaclassify，IIRC）对D期RB患儿的治疗成功率的预测只有50%[3]，对E期RB患儿的预测更少[4]，因此临床亟需一种更精准的方法来评估和预测RB患儿的保眼临床疗效。

由于担心肿瘤的针道种植转移，只能从RB患儿眼球摘除后取标本行基因测序及其他生物化学检查，而不能像其他实体肿瘤一样进行活检，因此RB的基因诊断与个性化治疗受到很大限制。JesseL等[5]发现RB房水的基因检测可以用于替代肿瘤的活组织检测来预测临床疗效，为精准治疗打开了大门[6-7]。基于此，本研究通过检测、比较RB眼球摘除后房水、肿瘤基因信息等，初步探讨RB液体活检的意义。

资料与方法

一、一般资料

医院伦理审查委员会批准。治疗前所有患儿监护人都获得了知情同意。本研究共纳入2例保眼失败的RB患儿。

病例1：男，5岁，右眼RB，IIRCE期，前房可见肿瘤种植，曾行1次经眼动脉灌注化疗，眼底检查示疗效较差，予以眼球摘除。

病例2：男，4岁，右眼RB，IIRCD期，曾6次全身化疗后肿瘤复发，经3次经眼动脉灌注后肿瘤控制欠佳，出现玻璃体混浊，窥不清眼底，予以眼球摘除。

二、方法

眼球摘除后先吸取房水0.5ml，再切取少量肿瘤组织。所有样本避免溶血，取样后立即保存于-80℃冰箱内，在取样后1个月内完成检测。

分别采用AmpGenomicDNAKit（天根）和QIAseqcfDNA提取试剂盒（Qiagen）从RB患者中提取肿瘤组织的基因组（gDNA），以及房水cfDNA。gDNA经过酶片段化，以50ng片段化的gDNA使用KAPAhyperplus进行酶切片段化，酶切时间选择12min，后经平末端修复，5’磷酸化和3’加腺苷酸尾、DNA连接酶等模块连接IlluminaTruseq接头后通过P5、P7端引物扩增后得到上机文库。房水中分离的cfDNA采用相同的NGS-DNA文库制备方法，但前期无片段化处理过程，采用10ngcfDNA构建测序文库。纯化的测序文库由Illuminanoveseq平台进行全基因组低覆盖度的高通量测序。在获得测序原始数据后，每条测序序列以95%以上碱基质量≥28分为阈值基准，利用Fastp质控及过滤工具（

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